6月18日開催（左側がホーム扱い）
- FC東京 vs ツエーゲン金沢
- ガンバ大阪 vs ヴィアティン三重
- 北海道コンサドーレ札幌 vs 大分トリニータ
- 横浜FC vs いわてグルージャ盛岡
V・ファーレン長崎（J2) vs 筑波大学（茨城県代表）
会場：PEACE STADIUM Connected by SoftBank
関東大学1部に所属する大学サッカー界の名門、筑波大学。1回戦ではJ1昇格を目指すJ2のRB大宮アルディージャ（NACK5スタジアム大宮／1-0）を見事に撃破してみせた。筑波大は、過去に天皇杯で数々のジャイアントキリングを成し遂げており、この結果にはもはや驚きは少ない。
2017年には、当時J1のベガルタ仙台や当時J2のアビスパ福岡を破りベスト16に進出。昨2024年大会でも、当時J1首位を走る町田ゼルビアをPK戦の末に破ってみせた。今2回戦でも自信を持ってプロに挑んでくるだろう。2014年から指揮を執る小井土正亮監督は、Jクラブの倒し方を熟知しているかのようだ。
一方のV・ファーレン長崎は、前評判とは裏腹にJ2で苦戦を強いられている。優勝を本命視されていたものの、自動昇格の2位以上どころか、プレーオフ圏内の6位入りも危うい状況だ。リーグ戦に集中する必要があるため、下平隆宏監督は主力選手を温存し若手やサブメンバー主体で臨む可能性が高い。
その場合、モチベーションの高い筑波大にとっては大きなチャンスだ。若さに加え勢いもある筑波大が、再び敵地でJクラブを倒す可能性は低くないだろう。
柏レイソル（J1） vs 東洋大学（アマチュアシード）
会場：三協フロンテア柏スタジアム
昨2024年の全日本大学選手権（インカレ）で初優勝した東洋大学。1回戦では仙台大学を相手に4-2と撃ち合いを制し、天皇杯初出場にして2回戦進出を果たした。
